Abstract

formação de metástases é a principal razão para o extremamente pobre prognóstico em pacientes com câncer de pulmão de pequenas células (CPPC). Os parceiros de interacção molecular que regula a formação de metástases em CPPC são em grande parte não identificada, no entanto, a partir de outras entidades tumorais sabe-se que as células tumorais utilizam as moléculas de adesão da cascata de adesão de leucócitos para anexar ao endotélio no sítio da futura metástase. Usando a linha de SCLC OH-1 humano como modelo, verificou-se que estas células expressaram locais de ligação de E- e P-selectina, o que pode ser atribuído em parte ao motivo de ligação de hidratos de carbono sialil Lewis A. Além disso selectina, as espinhas dorsais de proteína que se sabe transportar estes glycotopes em outras linhas celulares, incluindo PSGL-1, CD44 e CEA pode ser detectado no

in vitro

e

in vivo

crescido células OH1 SCLC. Por microscopia intravital da vasculatura mesenterial murino pudéssemos capturar células SCLC enquanto rolando ao longo das paredes dos vasos demonstrando que as células SCLC imitar leucócitos rolando comportamento em termos de selectina e selectina interacção ligando in vivo, indicando que esse mecanismo pode ser realmente importante para as células SCLC para semear metástases à distância . Por conseguinte, a formação de metástases distantes espontâneos foi reduzida em 50% quando as células OH-1 foram xenoenxertados em ratinhos /P-selectina-E- deficiente em comparação com ratinhos de tipo selvagem (p = 0,0181). No entanto, como a formação de metástases não foi completamente abolida em murganhos deficientes selectina, concluiu-se que esta cascata de adesão é redundante e que outras moléculas desta cascata de mediar a formação de metástases, bem. Usando várias destas moléculas de adesão, como parceiros de interacção presumivelmente tornar as células SCLC tão altamente metastático

Citation:. Heidemann F, Schildt A, Schmid K, Bruns OT, Riecken K, Jung C, et al. (2014) selectinas Mediate pequenas células do câncer pulmonar sistêmica metástase. PLoS ONE 9 (4): e92327. doi: 10.1371 /journal.pone.0092327

editor: Andreas-Claudius Hoffmann, Cancer Center, da Alemanha Ocidental, Alemanha |

Recebido: 22 de novembro de 2013; Aceito: 21 de fevereiro de 2014; Publicação: 03 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Heidemann et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Bundesministerium für Bildung und Forschung (Tomcat, conceder número 01EZ0824; https://www.bmbf.de/) e Landesexzellenzinitiative Hamburg (Nanotechnology em Medicina – NAME). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) representa atualmente 13% de todos os tipos de câncer de pulmão e é a mais agressiva de todas as entidades do tumor do pulmão [1]. Devido ao tumor rápido tempo e disseminação haematog�ea início de duplicação, a sobrevida em 5 anos permanece abaixo de 5%, com uma taxa média de sobrevida de apenas alguns meses [2], [3]. CPPC tipicamente metastiza para o cérebro, fígado, medula óssea ou glândulas supra-renais. Porque a formação de metástases é geralmente a principal causa para a morte do cancro e baseia-se no facto de que os avanços terapêuticos em SCLC não surpreendentemente aumentar a sobrevivência a longo prazo dos pacientes, uma análise mais pormenorizada na cascata metastática de SCLC é urgentemente necessária.

Metástase – como uma marca do cancro da – é um processo de múltiplos passos começando com o crescimento descontrolado de uma célula de tumor primária que supera a membrana basal e envia sinais angiogénicos para que os novos vasos sanguíneos crescer para dentro da massa de células de tumor primário [4], [5]. Um subconjunto de células do tumor destaca a partir do tumor primário e entra na circulação. As células tumorais em circulação precisa escapar a partir da corrente sanguínea para invadir o tecido conjuntivo de um órgão distante. Portanto, as células de tumor circulantes interagem com o endotélio normal no local do órgão-alvo de um modo semelhante a de leucócitos. Depois de terem transmigrou o endotélio e ter resolvido no estroma de tecido conjuntivo, as células tumorais têm de dividir novamente, a fim de formar uma metástase clinicamente detectável [6], [7].

Leucócitos utilizar uma cascata de adesão celular moléculas de transmigrar para prender e células endoteliais, a fim de apresentar em estroma de tecido conjuntivo no local de uma inflamação. Esta cascata de aderência constituída por uma série de etapas a partir interrelacionados com amarras, seguida de laminagem, adesão, rastreamento intraluminal e é terminado por ou paracelular migração transcelular da célula endotelial [8]. O rolamento de leucócitos inicial na superfície luminal das células endoteliais é mediada no lado endotelial por uma classe de proteínas de ligação a hidratos de carbono chamados E- e P- selectina. Estas duas selectinas ligam a seus ligantes de carboidratos sobre os leucócitos em um Ca

2 + – forma dependente. O determinante hidrato de carbono consiste em sialil Lewis

X ou sialil Lewis

tetrassac�idos A [9]. conhecido ligando de selectina que transportam as espinhas dorsais de proteína são a PSGL-1, ESL-1 e CD44 [10]. Além de leucócitos [11], as células de tumor circulantes foram mostrados para expressar os ligandos de selectina conhecidos [6], [7], [12]. Por exemplo, os esqueletos de proteína PCLP-1 e CEA (CEACAM5) sobre células de cancro do cólon e da próstata podem ser glicosiladas com estruturas de açúcar que se ligam à selectina E [13], [14], [15].

a hipótese de que a metástase formação é mediada por selectinas é suportado por vários modelos de metástases espontâneas de células de tumores humanos xenoenxertados em ratinhos imunodeficientes. HT29 células de carcinoma do cólon [16], bem como células de carcinoma da mama DU4475 [17] transplantados para E- /P- selectina ratinhos deficientes mostraram uma diminuição significativa no número de metástases espontâneas no pulmão em comparação com ratinhos de tipo selvagem que expressam selectina. Poderia também ser demonstrado que a metástase peritoneal de adenocarcinoma pancreático, foi reduzida em murganhos deficientes em E- /P- selectina [18].

Investigações recentes sobre a linha celular de OH-1 que representam o fenótipo clássico SCLC [19] reveladas uma adesão firme de células OH-1 para uma proteína de fusão de E-selectina em condições de fluxo fisiológicas. OH-1 células exibido locais de ligação de selectina, bem como sialil Lewis X e PSGL-1 [20]. Por isso, a nossa investigação centrou-se na influência das selectinas no desenvolvimento de metástases em SCLC e seus ligantes selectina potenciais sobre células SCLC.

Materiais e Métodos

linha celular

A pequena linha celular humana do cancro do pulmão de células OH-1 foi obtido a partir de derrame pleural e gentilmente cedido por Uwe Zangemeister-Wittke (Universidade de Berna, Departamento de Farmacologia).

OH-1 as células foram cultivadas

in vitro

utilizando meio RPMI 1640 (Gibco /Life Technologies, Paisley, Escócia) complementado com soro de bovino fetal inactivado pelo calor a 10% (FBS, Gibco), 2 mM de L-glutamina (Gibco), 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina (Gibco), sob condição de cultura de células padrão (37 ° C, 100% de humidade relativa, 5% de CO

2).

transdução de Lentivirus

Para imagem de bioluminescência e microscopia intravital OH -1-LUC células /mCherry que expressam a luciferase de

Photinus pyralis

ea proteína fluorescente mCherry foram gerados. Para o efeito, o cDNA Luc2 (Addgene plasmídeo # 24337) foi clonado no 3

rd geração HIV1 SIN derivado vector Lego-IC2-Puro

+ [21]. Além mCherry como gene marcador, este vector lentiviral expressa puromicina N-acetil-transferase, que confere resistência à puromicina. partículas lentivirais foram produzidos como descrito [22]. Em resumo, as células 293T foram co-transfectadas com o plasmídeo vector LEGO-IC2-Puro

+ – Luc2 e os plasmídeos de empacotamento pHCMV-VSV-G, pMDLg /pRRE e pRSV-Rev por precipitação com fosfato de cálcio. Os sobrenadantes contendo partículas lentivirais foram colhidas 24 h após a transfecção. Os títulos funcionais foram medidos por análise de FACS de 3 dias após a transdução de células 293T. Para a transdução de células de lentivírus OH-1 1 × 10

5 células /ml foram semeadas em placas de 24 poços. Os sobrenadantes dia seguinte que contém as partículas virais e 8 ug /ml de polibreno (Sigma) foram adicionados durante 24 h. Para a seleção das células transduzidas OH-1, meio de cultura regular foi suplementado com 2,5 ug /ml de puromicina.

Citometria de Fluxo

A fim de avaliar os locais de ligação e seus backbones de proteína em células no celular superfície das células OH-1, células OH-1-LUC /mCherry cultivadas foram destacadas com celular dissociação buffer (Gibco, Carlsbad, EUA) e corado para sialil Lewis a (Abcam, a diluição 1:1000), CEA (Sinalização celular, a diluição 1:200 locais), CD44 (ABD Serotec, diluição 1:1000), a PSGL-1 (Santa Cruz, diluição 1:200), E- e P-selectina de ligação próprios usando E- e proteínas de fusão de P-selectina (R D Systems, de diluição para a e-selectina 1:1000, para a P-selectina 1:100), EpCAM (Dako, diluição 1:59), Muc18 (GeneTex, 1:1800) e NCAM (R D Systems, diluição 1: 1000). Os controlos de isotipo correspondentes (IgG1 para a PSGL-1, EpCAM, Muc18, CEA, E- e P-selectina; IgG2a para CD44 e NCAM; IgM de sialil Lewis A) foram incubadas em paralelo. A expressão anticorpo foi determinada com o fluxo FACS CALIBUR citômetro (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha) e analisado com Win MDI 2,9 software.

In vivo

crescido OH-1 células de um OH- primária tumor 1-Luc /mCherry foram investigados por análise FACS. As células foram duplamente marcada para anti-CEA e uma proteína de fusão E- ou P-selectina humana.

Intravital microscopia confocal

Para a microscopia intravital, intestino foi dissecada em ketamina /xilazina (230 mg /kg e 20 mg /kg de peso corporal) anestesiadas ratos PFP /RAG2 e veias mesentéricos foram visualizadas através de um microscópio confocal equipado com um scanner de ressonância (Nikon A1R). Para induzir a expressão de E- e P-selectinas sobre a superfície apical das células endoteliais, os ratinhos receberam uma injecção i.p. injecção de três horas investigação prévia-TNFa de murino. células OH-1-LUC /mCherry foram injectados através de um cateter na veia carótida, e 30 imagens por segundo confocais foram registados. Simultaneamente, veias mesentéricos foram observadas e mCherry marcado OH-1 células visualizadas por iluminação de fluorescência e registados durante 15 min com o plano do fluo óleo X40 /1.3 NA da lente objectiva e com o comprimento de onda de excitação de laser de 561 nm e filtro de emissão de 595 nm para mCherry, e com o comprimento de onda de excitação de 638 nm e filtro de emissão de 640 nm para o modo de reflexão. Mais tarde, foi analisada a dados adquiridos. Os leucócitos foram identificados como objectos rolantes não fluorescentes, células OH-1-LUC /mCherry como células fluorescentes vermelhas. foi determinada a cada evento de rolamento de células /mCherry-LUC OH-1 durante a gravação. Além disso, a velocidade de rolamento dos leucócitos e células de tumor foi calculado (NIS Elements). As gravações são anexados como vídeo suplementar.

xenotransplante de OH-1 e OH-1-LUC /mCherry células em ratinhos imunodeficientes

Todos os animais foram mantidos em um ambiente livre de patógenos com os melhores filtro gaiolas , alimentados com água estéril e ração ad libitum e constantemente observado e ponderado. Todas as manipulações foram realizadas sob condições assépticas. Para a inoculação, as células OH-OH-1 ou 1-LUC /mCherry foram trypsinated e as células viáveis ​​(5 × 10

6) foram suspensos em 1 ml de meio de cultura celular livre de FCS. Cada rato imunodeficiente (estirpes: PFP /RAG2, E /P-selectina deficiente PFP /RAG2, SCID) recebeu uma alíquota de 200 ul desta suspensão injectado por via subcutânea entre as escápulas ao ser sedados com CO

2 /O

2 – a anestesia. No início dos ratos experimentais foram idades entre 15 e 27 semanas e pesos variaram entre 17,4 ge 32,4 g.

A ressonância magnética (MRI) e imagem de bioluminescência (BLI) de tumores primários e metástases espontâneas

Para a detecção de metástases distantes espontâneas

in vivo

, as células OH-1-LUC /mCherry foram injectados subcutaneamente em ratinhos SCID (n = 3). branca da pele de ratos SCID com a /c Balb fundo facilitou a detecção do sinal de luminescência derivar a partir de células-OH 1-LUC /luciferase mCherry-positiva. MRI e BLI foram realizadas 18 dias após a implantação de células de tumor. Para RM um scanner Animais MRI 7-Tesla Bruker Clinscan (Bruker BioSpin RM GmbH, Ettlingen, Alemanha), bem como um turbo-bidimensional spin-eco sequência (TSE) (orientação axial de imagens de RM) foram usadas enquanto regula a murina a temperatura do corpo com um sistema de aquecimento do termopar. Para imagem de bioluminescência, luciferina (Sigma-Aldrich) foi injectado por via intraperitoneal (150 mg luciferina /kg de peso corporal) e a emissão de fotões foi medida com sistema IVIS 200 (Xenogen, CA, EUA). Em 54

th dia após a injecção de células OH-1-LUC /mCherry, o tumor primário foi cirurgicamente ressecado e, posteriormente processados ​​para histologia. No dia 117 sinais de luminescência foram medidos

in vivo

uma segunda vez. Pouco tempo depois, os ratinhos foram finalmente anestesiados com ketamina /xilazina (400 mg /kg e 35 mg /kg de peso corporal) e de tumor primário e órgãos (pulmão, coração, perna) foram removidos para

ex vivo

imagiologia e luminescência posteriormente processada para histologia. Para todos os procedimentos mencionados, exceto sacrificar, ratos, onde anestesiados com isoflurano inalado (1,5-2%).

metástase de OH-1-LUC /mCherry e oh-1 células em camundongos selectina com deficiência e tipo selvagem

ratinhos imunodeficientes PFP /RAG2 e camundongos PFP /RAG2 deficientes e /P-selectina foram utilizados [17]. Para a metástase de células-OH 1 3 PFP /RAG2 e 5 E /P-selectina pfp deficiente /RAG2 ratos (27 a 32 semanas de idade) foram usadas. Os ratos foram sacrificados quando falhou o sistema de pontuação de saúde UKCCCR ou tumores começaram a ulceração. Os tumores primários e os pulmões foram retirados e fixados em formalina 4% para mais investigação.

Para a metástase de OH-1-LUC células /mCherry 20 PFP /RAG2 e 20 E /P-selectina PFP deficiente /RAG2 foram utilizados ratos (15 a 27 semanas de idade). Entre o dia 32 e 41 após a injecção das células OH-1-LUC /mCherry, o tumor primário foi removida cirurgicamente e subsequentemente processada para histologia. Animais viveram até que falhou o sistema de pontuação de saúde UKCCCR e finalmente foram anestesiados com ketamina /xilazina (400 mg /kg e 35 mg /kg de peso corporal) e a luciferina foram i.p. aplicado. Lung, perna e coração foram removidos para a

ex vivo

luminescência de imagens e, posteriormente processados ​​para imuno-histoquímica

Histologia

Para hematoxilina /eosina (H E). Coloração e imuno-histoquímica, tecidos fixados em formalina foram embebidos em cera de parafina de acordo com procedimentos laboratoriais normalizados. Cinco mm de espessura foram cortadas usando um micrótomo trenó (Techno Med. GmbH, Bielefeld). Cada seção 10 de cada pulmão foi salvo para a H E coloração e, adicionalmente, duas séries de 20 seções a seguir para fora do meio de cada pulmão foram retidos por imuno-histoquímica. H /E coloração foi realizada de acordo com o protocolo padrão de laboratório. Dez secções H /E coradas fora do centro de cada pulmão foram examinadas através de microscopia de luz a 400 x de ampliação, ao passo que as lâminas foram cegos para o exame. A avaliação quantitativa de metástases pulmonares foi realizada como descrito anteriormente [23].

Imunohistoquímica

As secções de parafina foram desparafinados, reidratados e tratadas para recuperação antigênica. Os anticorpos utilizados foram os seguintes anti-EpCAM (clone MOC31, DakoCytomation, Carpinteria, EUA), anti-CD44 (MCA2726T, AbD Serotec, Düsseldorf, Alemanha), anti-CEA (# 2383, sinalização celular, Beverly, MA, EUA) e PGP9.5 anti- (Dako, Hamburgo, Alemanha). Para a coloração de anticorpo anti-EpCAM, as secções foram incubadas com proteinase Tipo XXIV (Sigma, Aldrich, Steinheim, Alemanha). Para o anticorpo anti-CD44 e coloração com anticorpos anti-CEA foram microondas em 10 mM de tampão de citrato (pH 6,0). recuperação de epítopo induzida pelo calor para a coloração de anticorpo anti-PGP9.5 foi realizada utilizando Dako alvo Recuperação Sol. S3307. Após a lavagem com TBS, a ligação não específica foi bloqueada por 30 minutos de incubação com 10% de soro normal de coelho (Dako, X0902, Hamburgo, Alemanha) para o anti-CD44, anticorpo anti-ACE e anti-EpCAM (Dako, Hamburgo, Alemanha) ou 10% de soro de suíno para anti-PGP9.5 (Dako, Hamburgo, Alemanha), respectivamente. As secções foram incubadas durante 60 minutos a concentrações iguais dos anticorpos primários e os correspondentes controlos de isotipo, que serviram como controlos negativos: CD44 (diluição 1:25) e o seu controlo de isotipo de IgG

2b, o CEA (diluição 1:100) e isotipo controle de IgG

1 rato, EpCAM (1:35) e IgG1 de controlo do isotipo, bem como PGP9.5 (1:200) e sua IgG de controlo de isotipo de coelho, respectivamente. Todos os anticorpos foram diluídos em diluente de anticorpo Dako (S2022, S3022). Após lavagem intensiva em TBS, as secções foram tratadas com um anticorpo anti-rato de coelho biotinilado para CD44, CEA e EpCAM ou anticorpo anti-coelho de suíno para PGP9.5 a uma diluição de 1:200 durante 30 minutos, respectivamente, seguido por incubação com fosfato complexo avidina-alcalina (kit ABC, Vectastain, Vector, Burlingame, CA) durante 30 minutos. Após mais lavagens, a actividade da fosfatase alcalina foi visualizada utilizando naftol-AS-bisphosphat como substrato e nova fucsina como cromogénio. As secções foram contrastadas com und hemalum de Mayer montado com Aquatex (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha). As secções foram fotografadas utilizando um microscópio foto equipado com uma câmera digital (Axioplan 2 com MRC5 câmera digital, Zeiss Göttingen, Alemanha).

absorvente de multi matrizes de amostras clincal

Tecido de vários matrizes (TMA) dos tumores primários SCLC foram fornecidos por Katharina Schmid, Instituto clínico de Patologia, Universidade médica de Viena, na Áustria. Um total de 70, os tecidos de câncer de pulmão embebidos em parafina fixadas em formol de pacientes que tinham sido operados foram incluídos neste estudo. Casos que tinham sido selecionados entre 1986 e 2005 incluiu 43 do sexo masculino e 27 do sexo feminino. A idade média da amostra de pacientes foi de 63 ± 10,7 (intervalo 35-92 anos). Os casos foram classificados de acordo com a OMS Lung Cancer Classificação 2004. As características da população em estudo estão resumidos na tabela 1.

Avaliação imuno-histoquímica de TMA

O CEA e CD44 níveis de expressão foram avaliadas sob um microscópio (Zeiss, Axioplan 2, Göttingen, Alemanha) por dois observadores independentes (MH e norte-americanos) cegos aos dados clínicos. Se nenhum consenso foi alcançado em primeira instância, os casos foram discutidos até concordância dos observadores foi atingido. níveis de coloração foram classificados de acordo com a intensidade de coloração (coloração negativa, moderada e forte). As amostras foram consideradas positivas se . 50% das células tumorais foram moderadamente ou intensamente coradas

A análise estatística

curvas

sobrevida foram construídas pelo método de Kaplan-Meier e comparadas pelo log-rank teste. Um bicaudal P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism (Graphpad Software, Inc., CA, EUA.)

Ética Declaração

A metodologia para a realização dos experimentos com animais foi consistente com as diretrizes UKCCCR para o bem-estar dos animais na pesquisa do câncer. O experimento foi supervisionada pelo oficial de bem-estar animal institucional e aprovado pela autoridade de licenciamento local (Behörde für Soziales, Familie, Gesundheit und Verbraucherschutz;. Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hamburgo, Alemanha, o projecto n 92/09).

Resultados

Adesão molécula de expressão de OH-1 células SCLC crescido

in vitro

primeiro foi investigada a presença de sítios de ligação E- e P-selectina, que eram ambos presentes em células OH-1 cultivadas

in vitro

(Fig. 1). Para analisar ainda mais a natureza destes sítios de ligação, foram investigados quanto à presença de E- e P-selectina ligando sialil-Lewis A, que também estava presente. Em seguida analisou-se para o esqueleto da proteína de sialil Lewis conhecidos A e de veículos sialil Lewis X ou seja, CEA, a PSGL-1 e CD44, que também estavam presentes. Adicionalmente, examinámos OH-1 para mais moléculas de superfície celular que se sabe estar envolvida na metástase de câncer do que outras entidades SCLC. EpCAM, Muc18, bem como a molécula de adesão neuronal MACN poderia também ser detectada a um nível de expressão elevado.

OH-1 de células, como uma linha celular de origem neuroectodérmico, são positivos para NCAM e EpCAM, que pode ser detectado por análise de citometria de fluxo e pode, assim, servir como um marcador para estas células quando crescidos em ratinhos. Células mostram a ligação a E- e proteína de fusão P-selectina. A sialil Lewis A glicosilação motivo, um parceiro de ligação reconhecido por selectinas, pode ser detectado com o anticorpo CA19-9. A linha celular OH-1 apresenta várias proteínas conhecidas que se sabe serem backbones de proteínas para a ligação de resíduos de carboidratos, como PSGL-1, MUC18, CD44 e CEA selectina. controles isotípicos são mostrados como linhas pontilhadas.

E- e ligação de células SCLC P-selectina crescido

in vivo

Com o uso de análise de FACS (Fig. 2) investigamos se

in vivo

cultivadas células OH-1 de tumores xenoenxerto primárias mantiveram a capacidade de se ligar a proteínas selectinas fusão. As células colhidas a partir de OH-1-LUC tumores primários /mCherry foram duplamente marcadas com o anticorpo anti-ACE e um E- ou P-selectina humana quimera. Quase todas as células (78%) foram positivas para CEA-anti coloração e de ligação de E-selectina (Fig. 2). coloração dupla de anticorpo anti-ACE e quimera selectina P humano revelou que 36% das células eram positivas para a ligação de P-selectina e do ACE (fig. 2C).

Isolado OH-1-luc células /mCherry dos tumores primários foram coradas em paralelo contra CEA e E- ou encadernação e FACS analisados ​​P-selectina. (A) As células-OH 1-LUC /mCherry não mostrou ligação a controlos de isotipo e FC-quimera. (B) Quase todas as células foram CEA e E-selectin de ligação positiva, por outro lado (C), dois terços das células eram negativas de ligação de P-selectina. controles isotípicos são mostrados como linhas pontilhadas.

In vivo

comportamento das células circulantes SCLC

células OH-1-LUC /mCherry rolando na TNF-α tratada paredes dos vasos, como leucócitos foram identificados através de microscopia confocal intravital rápido (Figura 3A e filme S1). Como também encontramos leucócitos de rolamento, a velocidade de rolamento de ambos os tipos de células foram medidos. Leucócitos mostrou um rolamento velocidade média de cerca de 50 mm /seg e OH-1-luc /células mCherry de 350 um /s (Fig. 3B). Assim, o rolamento velocidade média de células OH-1-LUC /mCherry foi de aproximadamente sete vezes mais rapidamente do que a de leucócitos, indicando que as células SCLC imitar leucócitos que rolam comportamento, no entanto, a uma eficiência menor aderente.

comportamento de rolamento injectado de células fluorescentes OH-1-LUC /mCherry (mCherry, vermelha) nas veias do mesentério (modo de reflexão, cinzento) foram visualizadas em tempo real com imagem latente intravital confocal de alta velocidade. (A) O comportamento de rolamento de um OH-1-LUC células /mCherry foram observados durante 27 segundos. (B) Média rolando velocidade de injetadas células OH-1-LUC /mCherry e leucócitos endógenos em veias mesentéricas foram determinados com imagens intravital alta velocidade (Nikon A1R microscópio confocal). Barra de escala:. 500 mm para (F) e (H), 50 mm para (G)

sítios metastáticos SCLC em ratinhos imunodeficientes

Para investigar o local metástase espontânea de SCLC células de células OH-1-LUC /mCherry foram injectados subcutaneamente em ratinhos SCID como um xenoenxerto. A fim de não-invasiva verificar OH-1-LUC /mCherry primária

in vivo

o crescimento do tumor, MR e imagem de bioluminescência foram realizadas. No dia 18 após OH-1-LUC /mCherry inoculação a existência do tumor primário OH-1-LUC /mCherry, que apareceu como uma lesão intensiva hiper em imagens de RM axiais ponderadas em T2, foi demonstrada no local da inoculação localizada entre o escápulas (Fig. 4A). As imagens exibidas bioluminescência correspondentes sinais de luminescência derivadas dos tumores OH-1-LUC /mCherry (Fig. 4B). À medida que o crescimento do tumor primário era demasiado rápida para localizar as pequenas metástases de uma forma não-invasiva, o tumor primário foi ressecado no dia 54 após a inoculação OH-1 e 63 dias mais tarde, os ratinhos foram de novo inquérito para

In vivo

luminescência. sinais de luminescência podia ser detectada na área do focinho, parte superior do peito e a perna posterior esquerda (Fig. 4C). Para validar a presença de metástases nos tecidos nesses locais foram excisadas depois de sacrificar os animais ea bioluminescência foi de novo inquérito

ex vivo

. sinais intensas podem ser verificados nos pulmões (Fig. 4D) e articulação do joelho (Fig. 4E), enquanto que o coração não mostraram qualquer sinal (Fig. 4D). Para verificar que as áreas bioluminescentes metástases eram de facto, o exame histológico foi realizado. células tumorais vitais do tumor OH-1-LUC /mCherry foram localizados em torno de uma necrose central (Fig. 4F). Pulmão e metástases ósseas podem ser confirmadas adjacente aos tecidos saudáveis.

OH células-1-LUC /mCherry foram implantados subcutaneamente (A) e cultivadas como um tumor primário (um) durante 18 dias no local entre as escápulas (b) com uma aparência hiper-intensivo em uma sequência bidimensional de turbo spin-eco (TSE) (imagens de RM em orientação axial) e um sinal positivo bioluminescência (b) do OH-1-LUC /mCherry tumoral correspondente como no painel A. O tumor primário removido cirurgicamente foi de 51 dias após a injecção das células OH-1-LUC /mCherry. (F) correspondentes secções de parafina de tumor ressecado revelou células tumorais (e) que vivem em torno de uma necrose central (F). (C), sinais de luminescência de metástase as células de OH-1-LUC /mCherry in vivo eram detectáveis ​​nas áreas de focinho, fémur distai e o peito 117 dias após a injecção. Os órgãos foram removidos e os sinais bioluminescentes foram confirmadas ex vivo. (D) Os pulmões mostraram vários pontos de luminescência (C), enquanto o coração (d) não mostrou qualquer sinal de luminescência. (L) H E a coloração de secções de pulmão correspondente mostrou um um pequeno depósito metastático rodeados por tecido de pulmão normal (g). (E) A luminescência da tíbia na articulação do joelho pode ser detectado e (H) H E de coloração de uma secção de parafina osso correspondente mostrou metástase OH-1-LUC células /mCherry (i) ao lado de medula óssea saudável (h). Barras de escala: 500 mm para (F) e (h), 50 mm para (G)

Papel da E- e P-selectina para a metástase

in vivo

uma vez que as células da linha de células SCLC positiva CEA células OH-1-LUC /mCherry metástase com sucesso em ratos imunodeficientes, investigamos o papel de e- /P-selectinas para este processo de

in vivo

.

células OH-1-LUC /mCherry foram injectados por via subcutânea em tipo selvagem (wt) e E- knockout /P-selectina deficiente (select) camundongos. tumores resultantes foram ressecados após 31-41 dias, e seu peso foi determinada (Fig. 5A). Nós não poderia detectar qualquer diferença estatisticamente significativa entre os tumores cultivados em ratinhos WT e selecione, indicando que o status selectina dos ratos imunodeficientes não influenciou diretamente a proliferação de células tumorais. camundongos ressecados tumorais viveu até que chegaram os critérios de terminação. Kaplan Meier curva de sobrevida revelou uma diminuição significativamente a sobrevida mediana de peso (n = 20) em ratinhos comparada com os ratos select (n = 20) (teste-log rank, p 0,0001) (Figura 5B e tabela 2.). Pulmões e pernas foram removidos e analisados ​​separadamente para intensidade de bioluminescência. Poderíamos mostram uma diferença significativa entre os órgãos de peso (n = 12) e seleccionar os ratos (n = 18) com a redução do sinal de bioluminescência dentro dos pulmões (Fig. 5C) e pernas (Fig. 5D) a partir dos ratos de selectina-deficiente em comparação com os ratinhos wt indicando uma carga metastática consideravelmente reduzido nos ratinhos deficientes selectina (teste de Mann-Whitney, p = 0,0003).

OH células-1-LUC /mCherry foram injectados por via subcutânea no E- /P-selectina duplo camundongos knockout (selecionar) ou tipo selvagem ratos maca (WT) e tumores resultantes cultivada por 31-41 dias. Os tumores foram ressecados e ponderados. (A) Não houve diferença com relação a peso de tumor estatística poderia ser determinado (teste t de Student, p = 0,5025). camundongos ressecados tumorais viveu até chegarem critérios de ponto final. (B) curva de sobrevivência de Kaplan Meier mostra diminuiu significativamente a sobrevida mediana de peso (n = 20) em ratinhos comparada com select (n = 20) ratos (teste-log rank, p 0,0001). Os órgãos foram removidos e um peso diferença significativa comparando (n = 12) e seleccionar os ratos (n = 18) foram determinados em termos de bioluminescência dos pulmões removido (C) e as pernas (D) (teste de Mann-Whitney, p = 0,0003 ). Numa abordagem paralela células OH-1 foram injectados por via subcutânea em Select (n = 5) ou em peso (n = 3) e ratinhos tumores cultivados para 36-65 dias. Os órgãos foram removidos e o peso do tumor foi determinada. Não houve diferença estatisticamente significativa no peso dos principais OH-1 tumores entre linhagens de camundongos (E) (teste t de Student, p = 0,6489). Foram determinados o número de metástases pulmonares espontâneos em camundongos selecionados e wt. Note-se que o número de metástases foi estatisticamente significativamente reduzida em 50% no seleto ratos em comparação com ratos de tipo selvagem (F) (teste t de Student, p = 0,0181).

Para excluir o influência de transdução lentiviral sobre a taxa de metástase analisou-se a linha celular parental OH-1 numa abordagem paralela. OH-1 foram injectados por via subcutânea em Select (n = 5) ou em peso (n = 3) e ratinhos tumores cultivados para 36-65 dias. Pulmões e tumores primários foram removidos e o peso do tumor foi determinada. O peso médio do tumor (Fig. 5E) foi 1,53 g (n = 3) no tipo selvagem e 1,72 g (n = 5) nos ratos duplamente deficientes selectin-. Não houve diferença estatisticamente significativa no peso dos principais OH-1 tumores entre linhagens de camundongos (estudantes teste t, p = 0,6489). Além disso, todos os ratinhos desenvolveram micrometástases espontâneas para o pulmão. No entanto, o número de metástases para os pulmões diferiu significativamente entre o tipo selvagem e a estirpe de ratinho E /P-selectina-deficiente. O número de metástases à distância em ratinhos de tipo selvagem variou entre 47560 e 72165 (média: 61076) e em E metástases ratos duplamente deficientes /P-selectina variou entre 16790 e 53317 (média: 28446) (Fig. 5F). Note-se que a ausência de E- e P- selectina diminuiu o número de metástases pulmonares espontaneamente desenvolvidas em 50% (teste t de Student, p = 0,0181).

detecção imuno-histoquímica da proteína ligando da selectina espinhas dorsais de células SCLC

in vivo

Para investigar que os ligandos de selectina e outras moléculas de superfície celular foram expressos

in vivo

em tumores primários e metástases analisamos a sua expressão por imuno-histoquímica (Fig. 6). O ligando da selectina CEA estabelecida pode ser detectada em tumores primários e mesmo observado com uma expressão aumentada em metástases do pulmão e osso. CD44 e EpCAM, conhecido por estar presente em uma variedade de entidades tumorais, também foram expressas em tumores e metástases pulmonares com um alto grau. Além disso, a proteína marcadora PGP 9.5 SCLC, também conhecido como UCH-L1, abundantemente expressa nas células das metástases de tumor primário, pulmão e osso.

OH primário-1 de tumor, bem como espontânea OH-1